loader
AKRON Srl

Gli enzimi nella nutrizione dei ruminanti


Articoli

08 Ottobre 2021

Sylwia Bochenska fa una panoramica su funzionamento e applicazioni degli enzimi, con un focus particolare su quelli prodotti da #Aspergillusoryzae.

Effetti degli enzimi sulla degradazione ruminale degli alimenti zootecnici e sulle prestazioni degli animali.

“Enzima è un termine generico che indica un catalizzatore proteico che si forma all’interno delle cellule degli esseri viventi. Ovunque vi sia vita, in animali o piante, gli enzimi sono al lavoro. Prendono parte a tutti i processi necessari a sostenere la vita: sintesi, trasporto, decomposizione, escrezione, disintossicazione e rifornimento di energia. Più di 5000 tipi di enzimi vengono creati all’interno delle cellule del nostro organismo e vengono prodotti anche a partire dagli enzimi che si ritrovano negli alimenti che consumiamo ogni giorno.”

Dott. Hiromi Shinya

Il rumine è un ambiente microbico altamente adattivo, diversificato e competitivo, in un constante stato di attività anche nel corso di un solo giorno. Tuttavia, esiste la possibilità di migliorare la funzionalità di questo organo e di alterare la fermentazione ruminale utilizzando Direct Feed Microbical (DFM) a base fungina grazie alla loro produzione di enzimi extracellulari. Le motivazioni della manipolazione ruminale sono radicate nel desiderio di apportare cambiamenti positivi e incrementali per ottimizzare la fermentazione e le prestazioni senza che si verificano disturbi digestivi. L’avvento della tecnologia che permette di studiare su larga scala non solo l’ecologia dei microrganismi nel rumine ma anche la loro capacità funzionale nel contesto della funzione digestiva, ha notevolmente migliorato la nostra conoscenza fondamentale di questo ecosistema.

Molte sono le potenzialità dei fermentati per la produzione di sostanze che aiutino la fisiologia e la nutrizione animale garantendo risultati eccellenti in totale bio-sicurezza. Fermentazioni guidate danno origine a complessi ricchi in metaboliti ed a prodotti di grande efficacia in forma attiva e assimilabile.

Esistono diverse possibili ragioni per migliorare la fermentazione ruminale tramite enzimi.

L’Aspergillus oryzae gioca in questo contesto un ruolo chiave nel sistema digerente di tali animali, grazie alla produzione esogena di famiglie di enzimi idrolitici capaci di degradare i costituenti delle pareti cellulari delle piante, come ad esempio lignina, cellulosa ed emicellulosa.

L’estratto di fermentazione di Aspergillus oryzae è stato somministrato agli animali per promuovere le risposte desiderate, come:

  • aumento di peso,
  • produzione di latte,
  • digeribilità del tratto totale dei componenti degli alimenti.

Indubbiamente, il modo di agire degli enzimi esogeni nei ruminanti è estremamente complesso.

Enzimi, modalità di azione

Ad una prima analisi, ci si potrebbe aspettare che gli enzimi alterino l’utilizzo degli alimenti attraverso i loro effetti sugli alimenti stessi prima del consumo e/o attraverso il loro potenziamento della digestione nel rumine e/o nel tratto digestivo post-ruminale.

All’interno del rumine troviamo un’abbondante quantità di alimenti che si trovano spesso sotto forma di polimeri complessi. Questi devono essere ridotti a sostanze con basso peso molecolare da enzimi extracellulari prima di poter essere utilizzati. Quando questi enzimi agiscono all’esterno della cellula batterica che li ha prodotti, anche i microrganismi incapaci di secernerli si trovano a disposizione le stesse molecole potenzialmente utilizzabili.

Il compartimento più facilmente analizzabile risulta la frazione liquida. Batteri liberi di muoversi nel liquor ruminale, protozoi e zoospore fungine utilizzano nutrienti solubili (zuccheri, peptidi, aminoacidi). Questi composti sono tuttavia disponibili solo per un breve lasso di tempo, successivo all’ingestione da parte dell’animale. La maggior parte della frazione planktonica appare in fase di transito composta da cellule figlie di microrganismi già adesi ad un substrato e “in cerca” di un nuovo sito dove legarsi. Alcuni batteri che digeriscono le cellule epiteliali sono ancorati alle pareti ruminali (proteolitici) e sono attivi nell’idrolisi dell’urea e nella riduzione delle piccole quantità di ossigeno che entrano nel rumine per via della pressione sanguigna. Una ben più grande frazione batterica, invece, si trova nel biofilm adesi alla superficie delle particelle di cibo e coinvolge diverse specie batteriche contemporaneamente. Questo biofilm comprende enzimi in grado di lavorare in maniera altamente sinergica. 

Gli effetti preconsuntivi degli enzimi possono essere semplici, come il rilascio di carboidrati solubili, o complessi, come la rimozione delle barriere strutturali che limitano la digestione microbica degli alimenti nel rumine.

All’interno del rumine, gli enzimi potrebbero agire direttamente sull’alimento o stimolare indirettamente l’attività digestiva attraverso l’effetto sinergico con i microrganismi ruminali.

Gli enzimi possono rimanere attivi nel tratto digerente inferiore, contribuendo alla digestione post-ruminale delle fibre, o potrebbero indirettamente migliorare l’assorbimento dei nutrienti nel tratto inferiore, riducendo la viscosità della digestione intestinale.

In conclusione, l’obiettivo dell’uso degli enzimi è quello di migliorare l’efficienza dell’utilizzo degli alimenti nei ruminanti e ridurre gli sprechi della produzione.

Fonti di enzimi

Sebbene i prodotti enzimatici commercializzati siano centinaia, la produzione di enzimi deriva principalmente da 4 batteri (Bacillus spp, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum e Streptococous faecium spp) e 3 fungini (Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei e alcune specie di Saccharomyces cerevisae).

La capacità di attecchire alla superficie degli alimenti e di iniziare la degradazione prima che entri in azione la normale funzione digestiva, è una delle peculiarità del Aspergillus oryzae. In questo modo vengono scoperti i siti d’attacco per gli altri microorganismi e per gli enzimi sia microbici che pancreatici.

Ma focalizziamoci sugli enzimi ottenuti da Aspergillus oryzae

L’α-amilasi è un enzima extracellulare che catalizza l’idrolisi dei legami α-1,4-O-glicosidici interni nell’amido e nei polisaccaridi correlati, liberando zuccheri α-anomerici e limitando le destrine. L’α-amilasi supplementare ha migliorato la crescita dell’epitelio ruminale negli esperimenti con colture pure di batteri ruminali, mostrando come questo enzima abbia favorito la rapida crescita di batteri che non possono crescere, o che crescono lentamente, su amidi come Butyrivibrio fibrisolvens D1, Selenomonas ruminantium GA192 o Megasphaera elsdenii T81. Nei bovini da latte in lattazione, la α-amilasi supplementare ha:

  • aumentato la resa in latte senza ridurre quella in grasso,
  • migliorato la resa in proteine del latte.

Lo sviluppo ruminale è stimolato dalla produzione microbica di acidi grassi volatili (VFA) e soprattutto dal butirrato e dal propionato (McLeod e Baldwin, 2000). Circa lo 0,90% del butirrato ruminale può essere assorbito dal tessuto del rumine che, di conseguenza, fornisce energia per l’ispessimento della parete del rumine e lo sviluppo di papille e capillari (Weigand et al., 1975). L’α-amilasi supplementare prodotto da Aspergillus oryzae supporta il butirrato ed è utile per lo sviluppo dell’epitelio ruminale.

L’amilasi è secreta da fonti batteriche e fungine, compresi i ceppi di Aspergillus e Bacillus.

La cellulasi sono prodotti da un’ampia varietà di batteri e funghi, aerobi e anaerobi, mesofili e termofili. La cellulosa è la componente principale delle pareti cellulari delle piante ed è il polimero più rinnovabile della Terra. La sua struttura è costituita da un polimero lineare composto da 1,4-beta-glucosidico legati tra loro. Le singole molecole di cellulosa sono collegate tra loro da legami a H per produrre strutture più grandi e cristalline. A causa della complessità di questa struttura, la cellulosa cristallina non può essere legata dai singoli enzimi e la maggior parte degli animali non è in grado di utilizzare la cellulosa per ricavarne glucosio, poiché non possiede nell’intestino l’enzima in grado di rompere di glucosio della cellulosa, ossia di compiere l’idrolisi.

L’Aspergillus oryzae durante il processo di fermentazione, attraverso l’utilizzo di terreni di crescita appositamente ricercati e selezionati, è in grado di sintetizzare un ampio spettro di enzimi, tra cui la cellulasi, in grado di velocizzare il processo di idrolisi dei nutrienti. La degradazione microbica dell’amido, della cellulosa e dell’emicellulosa dà luogo alla formazione degli acidi grassi volatili che costituiscono la principale fonte di energia per l’animale.

La lattasi, nota anche come β-D-galattosidasi, è uno degli enzimi più importanti per l’idrolisi del lattosio nei suoi monosaccaridi, glucosio e galattosio. Le β-D-galattosidasi più comunemente utilizzate sono derivate da lieviti e fonti fungine. La principale differenza tra gli enzimi prodotti dal lievito e quelli fungini è il pH ottimale per l’idrolisi del lattosio. La fermentazione di Aspergillus oryzae permette l’applicazione della β-D-galattosidasi per l’idrolisi del lattosio nel latte e nel siero di latte, offrendo miglioramenti nutrizionali, tecnologici e ambientali alla vita degli animali.

La glucoamilasi (nota anche come glucan 1,4-alfa-glucosidasi) idrolizza estremità non riducenti dell’amilosio e dell’amillopectina, producendo monomeri di glucosio. A differenza dell’α-amilasi, tuttavia, la maggior parte delle glucoamilasi sono anche in grado di separare i legami 1,6-alfa nei punti di ramificazione dell’amilopectina, sebbene a velocità ridotta.

Destrine di glucosio maltosio sono i prodotti finali dell’idrolisi della glucoamilasi. La maggior parte delle glucoamilasi sono enzimi multidominio, costituiti cioè da un dominio catalitico collegato a un dominio legante, l’amido. Gli enzimi glucoamilasi sono stati isolati da numerose fonti microbiche. I funghi filamentosi, tra cui l’Aspergillus oryzae, costituiscono, invece, la principale fonte di glucoamilasi.

  • Le proteasi sono state ampiamente descritte come una diversa classe di enzimi noti per idrolizzare il legame peptidico (CO-NH) in una molecola proteica. Variano in relazione al loro pH ottimale e, di conseguenza, le proteasi alcaline sono prodotte da batteri e quelle acide da funghi. Gli enzimi proteolitici si trovano naturalmente negli organismi viventi e rappresentano il 2% di tutte le proteine presenti. Pertanto, le proteasi microbiche sono state ampiamente studiate e le loro proprietà molecolari sono comprese in dettaglio. I ceppi fungini filamentosi come Aspergillus, invece, sono stati ampiamente utilizzati dall’industria per la produzione di proteasi. Rispetto ai batteri, i funghi producono una varietà più ampia di proteasi con ampi intervalli di attività del pH.
  • Le proteasi sono suddivise in due gruppi principali, a seconda del loro sito di azione: esopeptidasi ed endopeptidasi. Le esopeptidasi, note anche come peptidasi, sono classificate in base al fatto che si separano da singoli amminoacidi dal terminale N o dal terminale C delle catene peptidiche e sono specifiche per i substrati dipeptidici.

Gli enzimi proteolitici di A. oryzae sono stati usati come aiuti digestivi in presenza di una carenza enzimatica.

Gli xilani sono importanti polisaccaridi strutturali presenti nelle cellule vegetali e sono caratterizzati da una struttura eterogenea composta da una catena principale di D-β-xilopiranasio con legame (1 → 4), con una varietà di sostituenti collegati alla catena principale di legami glicosidici o esteri. A causa dell’eterogeneità strutturale dello xilano, la completa degradazione richiede l’azione sinergica di diversi enzimi xilanolitici, come endoxilanasi, beta-xilosidasi, alfa-glucuronidasi, alfa-arabinofuranosidasi ed esterasi. L’endo-1-4-beta-xilanasi è il più importante, poiché avvia la degradazione dello xilano in xilo-oligosaccaridi e xilosio.

Le xilanasi sono diffuse tra una vasta gamma di organismi, tra cui batteri, alghe, funghi, protozoi, gasteropodi e antropodi. Alcune delle più importanti fonti fungine includono ceppi di Aspergillus e Trichoderma. Questi enzimi intervengono quindi nella degradazione dell’emicellulosa e sono generalmente attivi a temperatura mesofila (40-60 ° C) con un pH leggermente acido; tuttavia, è stato segnalato che le xilanasi sono attive anche in ambienti estremi.

Le fitasi idrolizzano un fattore anti-nutrizionale noto come fito o acido fitico per liberare inositolo e fosforo inorganico. Il fosforo è essenziale per la crescita e lo sviluppo di tutti gli organismi, svolgendo ruoli chiave nella struttura scheletrica e in percorsi metabolici vitali importanti. Gli effetti negativi delle diete carenti di fosforo per quanto riguarda il bestiame sono molteplici, tra cui riduzione dell’appetito, malformazione ossea e ridotta fertilità. Per contrastare questo problema, è necessaria l’assunzione di una fonte esterna di fosforo in quantità sufficiente per soddisfare le esigenze quotidiane dell’animale.

Valutazioni della produzione di enzimi: metodo in flacone

Questo metodo solitamente viene applicato dopo l’individuazione della produzione di enzimi fatta con metodo in piastra e consiste nel far crescere il ceppo in un terreno liquido costituito dai componenti utilizzati per la prova in piastra.

E’ un metodo puramente empirico e qualitativo. La valutazione viene fatta confrontando i cambiamenti del flacone inoculato col ceppo rispetto al “bianco”, considerando in particolare:

  • presenza o assenza di separazione di un surnatante,
  • velocità di separazione del surnatante,
  • aspetto del surnatante (se limpido o torbido),
  • quantitativo del surnatante.

In pratica, si preparano 2 flaconi di terreno: uno da inoculare con il ceppo e l’altro da tenere come “bianco”. Dopo opportuna incubazione alla temperatura ottimale del ceppo, si confrontano i 2 flaconi.

Come si può notare nella foto sovrastante, il flacone di sinistra presenta il substrato completamente limpido, segno evidente dell’avvenuta produzione di enzimi e conseguente degradazione del substrato.

Valutazioni della produzione di enzimi: metodo in piastra

Questo metodo serve ad evidenziare la capacità di un ceppo di produrre enzimi facendolo crescere su diversi tipi di terreni, ciascuno costituito da un unico componente (zucchero, proteina, chitina etc.). Ogni terreno viene formulato a 3 diversi pH e incubato a 2 diverse temperature (temperatura e pH, infatti, sono i 2 fattori che influenzano la produzione enzimatica).

Il metodo è molto semplice e consiste nel porre la broda-coltura del ceppo da testare a contatto con il terreno. Quindi, dopo opportuna incubazione, si procede verificando la formazione di eventuali aloni di chiarificazione. La presenza di tali aloni indica, infatti, la degradazione del terreno ad opera del ceppo e quindi la produzione di enzima.

E’ un metodo puramente empirico e qualitativo e la valutazione viene effettuata non solo verificando la presenza degli aloni di chiarificazione, ma anche le loro dimensioni.

Come si può notare nella foto il solo ceppo 618 è stato in grado di produrre l’alone ed è quindi l’unico ad avere prodotto l’enzima (nel caso specifico una α- amilasi).

Scritto da: